Méthodes optiques d’attribution d’identifiants moléculaires à des cellules uniques pour assurer leur traçabilité

Bien qu’apparues récemment, les technologies de séquençage de cellules uniques ont déjà largement illustré l’immense variabilité observable entre les cellules d’un tissu. Dès lors, nombre de techniques permettant de caractériser un échantillon biologique évoluent rapidement vers l’analyse individuelle de chaque cellule constituant l’échantillon. Cette variabilité est en effet porteuse d’informations déterminantes qui sont perdues lorsqu’une étude est réalisée en moyenne sur des millions de cellules. Or, si l’on exclut la microscopie, la majorité des protocoles applicables aux cellules uniques requiert une homogénéisation de l’échantillon en une suspension de cellules. Dès que la structure de l’échantillon est brisée, toute information concernant des éléments distinctifs facilement observables au microscope tels que la position, la forme, les contacts avec l’environnement, la direction et la vitesse de déplacement de la cellule étudiée est perdue. Ces éléments sont pourtant des descripteurs clefs du développement d’un embryon ou d’une pathologie, des réponses immunitaires, du fonctionnement du système nerveux, de la croissance et de la différenciation cellulaire. L’objectif de ce travail est de développer une approche qui permette d’associer une identité aux cellules d’intérêt afin d’en assurer la traçabilité tout au long des protocoles expérimentaux auxquels elles seront soumises par la suite. Les informations obtenues sur chacune de ces cellules par observation au microscope pourront ainsi être corrélées à celles obtenues lors d’analyses subséquentes. Dans un premier temps, notre but a été d’attacher un marqueur fluorescent à des cellules arbitrairement choisies une à une dans une image de microscope. Nous avons pour cela développé « Cell labeling via photobleaching » (CLaP). Cette méthode repose sur l’utilisation d’un laser pour photoblanchir un fluorophore, ce qui génère un radical libre et permet la liaison d’une biotine à la membrane plasmique des cellules. Cette procédure est non toxique, n’affecte pas le transcriptome des cellules visées et le marquage peut être détecté plusieurs jours après avoir été placé. Nous faisons la démonstration de principe de l’utilisation de CLaP en conjonction avec la plateforme Fluidigm C1TM pour obtenir la séquence de quelques cellules choisies individuellement dans un échantillon. Nous étendons ensuite l’utilisation de cet outil à des échantillons tridimensionnels, ainsi qu’à l’ancrage simultané de plusieurs étiquettes de couleur, et à la génération de liaisons entre les cellules et leur substrat afin de permettre leur isolation. Nous changeons ensuite de paradigme et, plutôt que d’essayer de reconnaître les cellules d’intérêt après avoir séquencé toutes les cellules de l’échantillon, nous cherchons à les isoler. Ces cellules purifiées restent viables et peuvent ensuite être séquencées, réinjectées, cultivées… Pour cela, nous proposons « Single-Cell Magneto-Optical Capture », scMOCA, une adaptation du précédent protocole qui permet de coller des billes magnétiques à la surface de cellules d’intérêt pour les extraire à l’aide d’un simple aimant. Ces manipulations nous ont permis de purifier sans dommages des cellules reconnues très sensibles tels des neurones primaires et des cellules souches embryonnaires. Nous démontrons les capacités de cette procédure en générant des lignées de cellules choisies pour leur capacité exceptionnelle à réparer les dommages induits à l’ADN et ainsi qu’en purifiant des cellules multinucléées jouant un rôle déterminant dans l’apparition des résistances aux médicaments et les récidives de cancer et finalement en extrayant les premières cellules qui se différencient en adipocytes à partir d’une culture de cellules 3T3.Even though they only recently appeared, single cell sequencing techniques have already highlighted huge variability among cells. Since then, numerous techniques arose that allow the characterization of each individual cell from a sample. This variability indeed holds crucial information that is lost when studies average observations across millions of cells. Outside of microscopy, most single cell protocols require the creation of a homogenized cell suspension from the sample. Because the spatial structure of the sample is broken, any information easily obtained with a microscope about shape, position, cell-cell contacts, migration direction and speed is lost. These descriptors are nevertheless key to understanding both embryo and pathology development, immune responses, nervous system functioning and cell growth and differentiation. The objective of this project is to develop a technique that allows giving an identity to cells of interest to trace them across any protocol they might later undergo. This will allow pairing microscopy generated information with that obtained with any downstream analysis. Our first goal was to tether fluorescent markers to cells that were individually chosen in a microcopy image. We developed Cell labeling via photobleaching (CLAP), in which a fluorophore is bleached using a laser to generate a free radical that allows binding a biotin to plasma membranes. This procedure is non-toxic, leaves transcriptomes untouched, and the tag can be found for several days. We show a proof of principle of the use of this technique with the Fluidigm C1TM platform to sequence individually chosen single cells. We then extended this new tool for 3-dimentional samples, for the simultaneous use of multiple color stamps, and for sorting cells by binding them to their substrate. We then considered the problem through a different angle: instead of trying to recognize data originating from single cells of interest after sequencing all cells from a sample, one can try to first isolate these few cells prior to sequencing, reinjecting or further culturing them. To this aim, we propose Single-Cell Magneto-Optical Capture (scMOCA), in which the above protocol is adapted to attach magnetic beads on cell surfaces. Viable cells can then be extracted with high efficiency and purity with a simple magnet; even from populations of very sensitive cells such as primary neurons or embryonic stem cells. Using this procedure, we generated cell lines selected for their outstanding ability to quickly repair induced DNA damage. We then purified multinucleated cells which are involved in the appearance of drug resistance and in cancer relapse and extracted cells that differentiated into adipocytes faster than the rest of the culture

Fabrication par électrofilage d’une structure à élution de facteurs de croissance pour contrôler la différenciation de cellules souches neuronales en neurones moteurs

RÉSUMÉ Les blessures médullaires et les lésions étendues des nerfs handicapent des milliers de nouvelles personnes chaque année aux États-Unis seulement. Il n’y a actuellement aucun traitement permettant la guérison de ces blessures. Une approche envisagée est la greffe de structures chargées de cellules souches pour rétablir les fonctions originelles du tissu. Ce travail vise donc à développer une méthode de fabrication d’une structure qui puisse offrir un support mécanique aux cellules, tout en délivrant sur place le cocktail de biomolécules adéquat pour diriger la différenciation des cellules vers le phénotype de neurone moteur. Afin de préparer cette structure, de la gélatine et de l’acide polylactique-L ont été co-électrofilés. L’électrofilage permet la fabrication de fibres de diamètre dépendant de la concentration des solutions en polymère. Les fibres ainsi fabriquées ont été réticulées afin de ralentir et contrôler leur dégradation. Les biomolécules permettant de promouvoir la différenciation des cellules en neurones moteurs, l’acide rétinoïque et la purmorphamine, ont été incluses dans la partie extérieure des fibres, en gélatine. Ces molécules ont diffusé de manière continue à partir des fibres, dans le milieu liquide. Les cellules implantées sur cette structure ont proliféré et se sont différenciées en neurones moteurs. Leur phénotype a été caractérisé par immunofluorescence.----------ABSTRACT Spinal cord injury and extended nerve injury currently have no cure. These pathologies are responsible for the decrease in quality of life of thousands of new people every year in the US only, and are draining huge costs to the healthcare system. Current research in the area focuses on the grafting of an artificial structure loaded with stem cells to restore tissue functions. The objective of this work is to propose a structure that can offer mechanical support to the cells, favor their proliferation, and promote their differentiation into motor neuron, by delivering in situ the appropriate cocktail of growth factors. Such structure was prepared by co-electrospinning of poly L-lactic acid and gelatin. Fiber diameter can be adjusted by controlling the polymer concentration. These fibers were crosslinked to slow their degradation. Retinoic acid and purmorphamine were included in the outer layer of gelatin. These two growth factors are known to direct cell differentiation towards a motor neurons phenotype and were continuously released from the fibers in the medium. Cells proliferated on the structure and differentiated into motor neurons. Their phenotype was characterized by immunostaining using sample images

Robust induction of functional astrocytes using NGN2 expression in human pluripotent stem cells

Summary: Emerging evidence of species divergent features of astrocytes coupled with the relative inaccessibility of human brain tissue underscore the utility of human pluripotent stem cell (hPSC) technologies for the generation and study of human astrocytes. However, existing approaches for hPSC-astrocyte generation are typically lengthy or require intermediate purification steps. Here, we establish a rapid and highly scalable method for generating functional human induced astrocytes (hiAs). These hiAs express canonical astrocyte markers, respond to pro-inflammatory stimuli, exhibit ATP-induced calcium transients and support neuronal network development. Moreover, single-cell transcriptomic analyses reveal the generation of highly reproducible cell populations across individual donors, mostly resembling human fetal astrocytes. Finally, hiAs generated from a trisomy 21 disease model identify expected alterations in cell-cell adhesion and synaptic signaling, supporting their utility for disease modeling applications. Thus, hiAs provide a valuable and practical resource for the study of basic human astrocyte function and dysfunction in disease